Aviso de segurança
Este artigo explica os princípios das técnicas. Ele não é um protocolo e não traz receitas nem quantidades. Coloração de bactérias envolve reagentes químicos e material biológico que exigem local adequado, equipamentos de proteção e orientação direta de professor ou responsável pelo laboratório. Não tente reproduzir essas técnicas em casa.
Por que corar
Corante é uma substância colorida que se liga a estruturas das células. Alguns têm afinidade por componentes de carga elétrica negativa, como os ácidos nucleicos do núcleo; outros se ligam a proteínas ou a componentes das paredes. Como cada corante tem preferências, a combinação deles revela estruturas diferentes na mesma amostra.
Uma coloração simples usa um só corante e mostra principalmente forma, tamanho e arranjo das células. Uma coloração diferencial usa mais de um reagente e separa tipos de células segundo uma propriedade, como a estrutura da parede. A de Gram é uma coloração diferencial.
Em geral, a amostra é espalhada na lâmina, seca e fixada antes da coloração. A fixação preserva a forma das células e ajuda a manter a amostra aderida ao vidro. Isso é diferente da montagem a fresco, em que o material é observado vivo.
Os corantes usados em microscopia costumam ser classificados em ácidos e básicos, conforme a carga elétrica do pigmento. Corantes básicos, de carga positiva, tendem a se ligar a componentes celulares negativos, como os ácidos nucleicos. Corantes ácidos tendem a se ligar a componentes de carga positiva, como muitas proteínas. É a diferença de afinidade que gera as cores distintas dentro de uma mesma célula.
Quem foi Gram e por que o método leva o nome dele
O método leva o nome do médico dinamarquês Hans Christian Gram, que o descreveu em 1884. Ele buscava uma forma de distinguir bactérias em tecidos. A técnica foi depois aperfeiçoada por outros pesquisadores e continua em uso, com variações.
A explicação da razão pela qual as bactérias reagem de modo diferente ao processo veio muito depois, com o estudo da estrutura da parede celular bacteriana.
A lógica da coloração de Gram
A técnica tem quatro etapas gerais. Primeiro, aplica-se um corante de cor violeta. Depois, um reagente que fixa esse corante dentro das células. Em seguida, usa-se um descolorante, que remove o corante de algumas células, mas não de outras. Por fim, aplica-se um segundo corante, de cor avermelhada, que colore as células que ficaram sem cor.
No resultado, as bactérias que retêm o corante violeta aparecem roxas e são chamadas Gram-positivas. As que perdem o primeiro corante e ficam com o segundo aparecem rosadas ou avermelhadas e são chamadas Gram-negativas. A cor, portanto, funciona como um rótulo de grupo.
O tempo e a ordem de cada etapa influenciam o resultado. Em especial, a etapa de descoloração é delicada: demorar demais ou de menos pode produzir um resultado errado. Por isso a técnica é treinada com supervisão.
Para entender por que a coloração é útil, pense no problema de olhar para uma amostra com muitos tipos de bactérias misturadas. Sem coloração, todas parecem iguais. Com ela, o observador separa de imediato dois grandes grupos e já sabe que tipo de parede esperar, o que orienta os passos seguintes de uma investigação.
O que explica a diferença de cor
A explicação aceita está na parede celular. Nas Gram-positivas, a parede tem uma camada espessa de peptidoglicano, um polímero que forma uma malha em volta da célula. Essa camada retém o complexo de corante durante a descoloração.
Nas Gram-negativas, a camada de peptidoglicano é bem mais fina e fica entre duas membranas: a membrana plasmática e uma membrana externa adicional. Durante a descoloração, o complexo escapa com mais facilidade e a célula perde a cor violeta.
Esse é um modelo explicativo da estrutura bacteriana. Ele dá conta da maioria dos casos, mas há bactérias que não se encaixam bem: algumas não coram de forma confiável pelo método e outras têm paredes de composição diferente.
Vale registrar que a membrana externa das Gram-negativas contém moléculas que não existem nas Gram-positivas. Essa diferença estrutural tem consequências para o modo como as bactérias interagem com o ambiente e com substâncias que atuam sobre elas. O assunto é extenso e é tratado com detalhe em livros de microbiologia.
O que se vê ao microscópio
Numa lâmina bem corada, observa-se a forma das bactérias, como bastonetes ou formas arredondadas, e o arranjo em que se agrupam: isoladas, em pares, em cadeias ou em cachos. A cor indica o grupo de Gram. Células pequenas como essas exigem aumento maior que o usado para células de plantas ou de animais.
A coloração de Gram dá informação útil, mas limitada. Ela não identifica sozinha a espécie. Na prática, serve como uma triagem inicial, a ser complementada por outros métodos de laboratório, conduzidos por profissionais.
Uma observação prática: culturas velhas de algumas bactérias Gram-positivas podem aparecer como Gram-negativas, porque a parede perde integridade com o tempo. Por isso, quem prepara as lâminas em laboratório costuma usar culturas jovens, em condições adequadas e, sempre que possível, amostras de referência para comparar. Essas precauções fazem parte da rotina de qualquer laboratório de microbiologia.
Outros corantes em microscopia
A histologia usa muito a combinação de dois corantes: um que cora o núcleo em tons azul-arroxeados e outro que cora o citoplasma e o material fora das células em tons de rosa. Essa dupla é a base de grande parte das lâminas de tecidos vistas em aulas e em laboratórios.
Há também corantes que marcam estruturas específicas, como a lignina nos tecidos vegetais, e corantes fluorescentes, usados em microscopia de fluorescência. A escolha depende sempre do que se quer ver.