O que é fluorescência
Algumas moléculas, chamadas fluoróforos, absorvem luz de uma cor e emitem luz de outra cor, geralmente de comprimento de onda maior. Esse fenômeno é a fluorescência. A luz que entra é a de excitação, e a que sai é a de emissão.
No microscópio, o princípio é aproveitado assim: a amostra é iluminada com a cor de excitação certa, e filtros deixam chegar ao olho ou à câmera apenas a luz emitida. O fundo fica escuro, e as estruturas marcadas aparecem brilhantes, com muito contraste.
O fenômeno é diferente da luz que alguns seres vivos produzem por reações químicas próprias, a bioluminescência. Na fluorescência, é preciso iluminar a amostra para que ela brilhe, e o brilho cessa quando a luz de excitação é desligada.
Como o microscópio de fluorescência funciona
O aparelho é, em essência, um microscópio óptico com uma fonte de luz intensa e um conjunto de filtros. Um espelho especial, chamado dicroico, reflete a luz de excitação em direção à amostra e deixa passar a luz emitida em direção ao detector. A escolha dos filtros depende do fluoróforo usado.
Cada cor de emissão corresponde a uma marcação diferente. Com isso, é possível observar vários componentes da mesma célula ao mesmo tempo e combinar as imagens em uma só. As cores finais costumam ser atribuídas por quem faz a análise, e por isso as legendas dizem o que cada cor representa.
Fontes de luz comuns incluem lâmpadas especiais e diodos emissores de luz. Cada fonte oferece uma faixa de cores, e a escolha deve combinar com o fluoróforo. Câmeras sensíveis registram a luz fraca e permitem acompanhar mudanças ao longo do tempo. O espelho dicroico e os filtros costumam ser reunidos em um bloco que se troca conforme a cor desejada.
Como marcar uma estrutura
Há várias formas de marcar o que se quer ver. Alguns corantes se ligam naturalmente ao DNA e destacam os núcleos. Outra estratégia usa anticorpos ligados a fluoróforos, que reconhecem uma proteína específica e a tornam visível. Uma terceira usa proteínas fluorescentes produzidas pela própria célula.
O exemplo mais conhecido é a proteína fluorescente verde, a GFP, originalmente isolada de uma água-viva, a Aequorea victoria. Ela pode ser ligada a outras proteínas por técnicas de genética, o que permite acompanhar onde elas estão dentro de células vivas. Osamu Shimomura, Martin Chalfie e Roger Tsien receberam o Prêmio Nobel de Química de 2008 pela descoberta e pelo desenvolvimento da GFP.
Antes da GFP, boa parte da marcação exigia fixar e tratar a célula, o que a matava. A possibilidade de usar proteínas fluorescentes em células vivas abriu espaço para filmar processos, como a divisão celular e o deslocamento de componentes internos.
O problema da luz fora de foco
Em uma amostra espessa, como um tecido ou um embrião, a fluorescência vem de todas as profundidades ao mesmo tempo. A luz de planos acima e abaixo do foco se soma à imagem e a deixa borrada, com um brilho difuso ao redor das estruturas.
Esse efeito não é falha do operador, mas consequência do modo como a luz é coletada. Para reduzir o problema, existem recursos de computador que tentam corrigir o desfoque depois, e também soluções ópticas que o evitam desde o início, como o microscópio confocal.
Em termos simples, é como fotografar uma cena iluminada por refletores em várias alturas ao mesmo tempo: o resultado mistura tudo. Em células isoladas e finas, o problema é menor, mas em tecidos ele é marcante.
O princípio confocal
O microscópio confocal coloca um pequeno orifício, o pinhole, diante do detector. Esse orifício deixa passar a luz que vem do plano em foco e bloqueia boa parte da luz de outros planos. O resultado é uma imagem mais nítida de uma fatia muito fina da amostra.
A ideia foi concebida por Marvin Minsky em meados da década de 1950, com pedido de patente em 1957. Nos aparelhos modernos mais comuns, a iluminação é feita por laser e varre a amostra ponto a ponto. Um computador junta os pontos e monta a imagem. Ao repetir o processo em várias profundidades, obtém-se uma pilha de camadas, chamadas cortes ópticos.
Há uma variante muito usada, o confocal de varredura a laser, mas existem outras formas de obter efeito parecido, como discos giratórios com muitos orifícios, que varrem vários pontos ao mesmo tempo e permitem imagens mais rápidas.
Reconstrução em três dimensões e limites
Com as camadas obtidas, o computador pode reconstruir a estrutura em três dimensões e permitir que ela seja girada na tela. Isso ajuda a entender como um núcleo, uma rede de fibras ou um conjunto de células se organizam no espaço.
Há limites. A luz intensa pode danificar a amostra viva, e os fluoróforos perdem o brilho com a exposição, efeito chamado fotobranqueamento. A resolução ainda é restrita pela natureza da luz, o que levou ao desenvolvimento de técnicas de super-resolução, tema de outro artigo.
Uma regra de bom senso: uma imagem de fluorescência mostra só o que foi marcado. A ausência de brilho não prova a ausência de uma estrutura, apenas que ela não foi marcada ou que o sinal ficou abaixo do que o aparelho detecta. Os pesquisadores usam controles para checar se a marcação é específica.