O limite da luz
A luz é uma onda e, ao passar por lentes, sofre difração, um espalhamento que faz um ponto minúsculo aparecer como uma pequena mancha. Em 1873, o físico Ernst Abbe descreveu que o menor detalhe distinguível depende do comprimento de onda da luz e das características da objetiva. Para a luz visível, esse limite fica da ordem de algumas centenas de nanômetros.
Muitas estruturas importantes da célula, como complexos de proteínas e partes de organelas, são menores ou próximas disso. Por isso, em um microscópio óptico convencional, elas não aparecem separadas. O microscópio eletrônico, que usa elétrons, escapa desse limite, mas exige amostras que não permanecem vivas.
Por isso, o desafio era outro: obter imagens nítidas de estruturas pequenas em células vivas ou em condições próximas das naturais. As duas técnicas deste artigo respondem a esse desafio por caminhos distintos, uma com luz e a outra com elétrons.
Como a super-resolução contorna o limite
A microscopia de super-resolução não quebra as leis da física. Ela usa truques que evitam que todas as moléculas brilhem ao mesmo tempo. A fluorescência, em que uma molécula chamada fluoróforo absorve luz e emite outra, é o ponto de partida.
Em uma família de métodos, um feixe de luz modelado em forma de anel desliga o brilho das moléculas ao redor de um ponto central, e só uma região muito pequena fica brilhando. Varrendo a amostra ponto a ponto, forma-se uma imagem mais nítida. Em outra família, as moléculas são ativadas poucas de cada vez, de modo que cada uma aparece isolada. Sua posição é calculada com grande precisão, e a imagem final é montada a partir de muitas posições combinadas.
O Prêmio Nobel de Química de 2014 foi concedido a Eric Betzig, Stefan Hell e William Moerner pelo desenvolvimento da microscopia de fluorescência de super-resolução. Hell é associado ao método do feixe em anel (conhecido como STED), enquanto Betzig e Moerner são associados aos métodos que trabalham com moléculas individuais.
O que se vê, e o que se calcula
Nas imagens de super-resolução, estruturas como o citoesqueleto aparecem com filamentos finos e bem separados, em contraste com o aspecto borrado da imagem comum. Essa é uma observação direta da distribuição das moléculas marcadas.
Mas há ressalvas. A imagem mostra apenas as moléculas que receberam marcador fluorescente, e o marcador pode, em princípio, alterar a molécula ou não cobrir todas elas. Em vários métodos, a imagem é reconstruída por computação a partir de muitas medidas, e não registrada de uma só vez. Interpretar essas imagens exige comparar com controles e outros métodos.
Outro cuidado é com o preparo da amostra. Fixar e marcar células pode introduzir artefatos, isto é, estruturas que aparecem na imagem por causa do preparo e não porque existiam na célula viva. Pesquisadores costumam testar a mesma estrutura com métodos diferentes para ter mais confiança de que o padrão é real.
Congelar para ver: a crio-microscopia eletrônica
A crio-microscopia eletrônica resolve outro problema. Para estudar a forma de uma proteína, era preciso, em geral, fazê-la formar cristais, o que nem sempre é possível. Na crio-microscopia, uma solução com as moléculas é congelada tão depressa que a água não forma cristais de gelo, e sim um estado vítreo, como um vidro. As moléculas ficam presas em posições variadas e em um ambiente próximo ao natural.
A amostra é então observada ao microscópio eletrônico, em baixa temperatura. As imagens individuais são ruidosas, porque a dose de elétrons precisa ser baixa para não danificar a amostra. A solução é fotografar milhares ou milhões de partículas e combiná-las por computador.
O Prêmio Nobel de Química de 2017 foi dado a Jacques Dubochet, Joachim Frank e Richard Henderson pelo desenvolvimento da crio-microscopia eletrônica para determinar a estrutura de biomoléculas em solução. De forma resumida, Dubochet é lembrado pelo congelamento em estado vítreo, Frank pelos métodos de processamento de imagens, e Henderson por demonstrar que o método podia revelar estruturas de proteínas em detalhe.
Do dado ao modelo
O resultado da crio-microscopia eletrônica não é uma foto de uma molécula, e sim um mapa tridimensional de densidade calculado a partir de muitas imagens alinhadas e combinadas. Sobre esse mapa, os pesquisadores constroem um modelo atômico, ou seja, posicionam átomos de modo a explicar a densidade observada.
O mapa é um dado experimental. O modelo atômico é uma interpretação, que pode ser mais ou menos confiável conforme a qualidade do mapa em cada região. Partes flexíveis das moléculas costumam aparecer com menos nitidez. Ao ler que uma estrutura foi determinada, vale lembrar que se trata de um modelo construído sobre dados, e não de uma imagem direta de cada átomo.
O avanço de câmeras mais sensíveis e de programas de análise melhorou muito a qualidade desses mapas na última década, ampliando o número de moléculas estudadas.
Perguntas em aberto
Ainda não há consenso sobre quanto das estruturas obtidas em condições de laboratório, congeladas e purificadas, reflete o estado das moléculas dentro de uma célula viva e cheia de outras moléculas. Técnicas que observam células congeladas inteiras tentam responder a essa pergunta e estão em desenvolvimento.
Da mesma forma, a super-resolução em células vivas enfrenta a dificuldade de usar luz intensa sem danificar a amostra. As duas áreas seguem em evolução, e os limites atuais podem mudar.
Vale lembrar que nenhuma técnica substitui as demais. O microscópio óptico comum continua sendo a ferramenta mais acessível para observar células inteiras e tecidos, e as técnicas avançadas respondem a perguntas específicas, em escalas que ele não alcança.